Di bawah pengawasan Pastur Silvano Bentivoglio (Carmen Argenziano) dan Dr. Vittoria Vetra (Ayelet Zurer), Organisasi Eropa untuk Riset Nuklir (European Organization for Nuclear Research atau CERN) melakukan proses Penumbuk Hadron Raksasa dan menciptakan tiga tabung partikel antimateri yang lebih besar daripada yang pernah diproduksi sebelumnya. Segera setelah itu, Pastur Silvano dibunuh dan salah satu tabung antimateri dicuri. Di saat yang sama, Gereja Katolik Roma sedang berduka karena kematian mendadak Paus Pius XVI di Roma dan sedang mempersiapkan konklaf untuk memilih Paus berikutnya. Sang Camerlengo, Pastur Patrick McKenna (Ewan McGregor), menjadi otoritas sementara Vatikan. Sebelum konklaf memasuki pengasingan, empat dari "preferiti" (kardinal potensial yang dipilih menjadi Paus) diculik oleh seorang lelaki (Nikolaj Lie Kaas) yang mengaku mewakili Illuminati. Menggunakan pesan video, penculik tersebut mengancam akan membunuh satu per satu kandidat setiap jam mulai pukul 8 malam dan mengebom semua wilayah kota Vatikan pada tengah malam menggunakan tabung antimateri yang hilang. Vatikan memanggil pakar simbolRobert Langdon (Tom Hanks) dari Universitas Harvard dan Vittoria dari CERN untuk membantu mereka menyelamatkan empat preferiti dan menemukan tabung antimateri tersebut.
Langdon menyimak pesan video Illuminati dan menyimpulkan bahwa keempat kardinal akan mati pada empat lokasi altar "Jalan Pencerahan", yang ditandai dengan patung-patung malaikat di lokasi yang identik dengan empat elemen klasik. Komandan Maximilian Richter (Stellan Skarsgård), kepala Garda Swiss tak mengizinkan Langdon masuk lebih dalam ke arsip-arsip Vatikan, tetapi dengan persetujuan McKenna, Langdon diberikan akses ke Arsip Rahasia Vatikan. Langdon meneliti buku Dialog Terkait Dua Sistem Utama Dunia karya Galileo Galilei dengan Vittoria. Di dalamnya, Langdon mencari petunjuk didampingi Inspektur Jenderal Ernesto Olivetti (Pierfrancesco Favino) dan Claudio Vincenzi (David Pasquesi) dari Angkatan Kepolisian Vatikan dan menemukan bahwa lokasi selanjutnya adalah Kapel Chigi di Gereja Santa Maria del Popolo. Di sana mereka menemukan Kardinal Ebner (Curt Lowens) tercekik oleh tanah dan dadanya dicap dengan kata ambigrammatik "Tanah". Mereka membuktikan lokasi kedua adalah Lapangan Gereja Santo Petrus dan tiba ketika Kardinal Lamassé (Franklin Amobi) yang berdarah muncul dengan dadanya dicap dengan kata ambigrammatik "Udara". Vittoria gagal mencoba untuk melakukan nafas buatan pada Kardinal Lamassé, hanya untuk menemukan paru-parunya telah ditusuk, sementara sang pembunuh menyelinap melalui kerumunan orang-orang.
Ketika Vittoria mempelajari buku harian Silvano, Langdon, Olivetti dan Vincenzi menemukan gereja ketiga, Santa Maria della Vittoria, tetapi mereka tiba dan melihat Kardinal Guidera (Bob Yerkes), yang dadanya dicap dengan kata ambigrammatik "Api" dan tergantung di atas tumpukan kayu yang terbakar. Insiden baku tembak terjadi antara sang pembunuh dan petugas kepolisian, membunuh Olivetti dan Vincenzi. Langdon berhasil melarikan diri, tetapi tidak sebelum ditemukan oleh si pembunuh. Langdon meyakinkan dua petugas Carabinieri (Victor Alfieri dan Todd Schneider) untuk membawanya ke lokasi selanjutnya, Fontana dei Quattro Fiumi, tepat ketika sang pembunuh tiba dengan mobil van. Sang pembunuh membunuh dua petugas Carabinieri dan menjatuhkan Kardinal Baggia (Marco Fiorini) yang terikat dan dicap di dadanya dengan kata ambigrammatik "Air" ke air mancur sebelum mengucapkan selamat tinggal kepada Langdon dan pergi. Dengan bantuan orang-orang sekitar, Langdon menyelamatkan kardinal, yang memberitahu Langdon bahwa sarang Illuminati adalah Castel Sant'Angelo. Di sana, Langdon dan Vittoria menemukan lorong tersembunyi menuju Vatikan, yang digunakan sebagai tempat persembunyian bagi si pembunuh. Menemukan lima simbol cap besi, mereka menyadari bahwa merek kelima tertuju ke Camerlengo, tetapi mereka berhadapan dengan sang pembunuh sebelum mereka dapat memperingatkan McKenna. Pembunuh tersebut membiarkan Langdon dan Vittoria hidup sekali lagi dan menyatakan bahwa membunuh mereka bukanlah bagian dari misinya, kecuali mereka mengejarnya. Sang pembunuh kemudian secara misterius memperingatkan mereka untuk berhati-hati karena bosnya adalah "hamba Tuhan" sebelum pergi meninggalkan mereka. Sang pembunuh melarikan diri ke mobil yang ditinggalkan oleh bosnya, tetapi sang pembunuh segera tewas karena ledakan mobilnya.
Langdon, Vittoria beserta pihak keamanan bergegas kembali ke Vatikan di mana mereka menemukan Komandan Richter dan McKenna, di mana simbol cap besi Vatikan dicap di dada McKenna. McKenna berteriak bahwa pelakunya adalah Komandan Richter dan Uskup Agung Simeon (Cosimo Fusco) ditembak oleh pihak keamanan. Ketika Komandan Richter meninggal di depan Langdon, ia membuka tangannya untuk mengungkapkan bahwa ia memiliki kunci, yang diambil kemudian oleh Langdon. Tabung antimateri yang dicuri ditemukan di Makam Santo Petrus di bawah gereja, tetapi masa penggunaan baterai di dalam tabung antimateri terlalu cepat habis. McKenna, mantan pilot militer, merebut tabung itu dan menggunakan helikopter yang menunggu untuk terbang di atas Vatikan. Pada ketinggian maksimum, ia menggunakan parasut ketika tabung antimateri meledak di langit. McKenna dipuji sebagai pahlawan dan penyelamat, lalu para kardinal bergegas untuk memilih McKenna sebagai Paus. Langdon dan Vittoria menggunakan kunci Komandan Richter untuk menonton video keamanan yang menunjukkan bahwa McKenna berbicara dengan Komandan Richter sebelum serangan itu. Video itu mengungkapkan bahwa dalang di balik pembunuhan kardinal dan pengeboman itu adalah McKenna, bukan Illuminati. McKenna mengungkapkan bahwa ia membunuh Paus Pius XVI karena ia merasa Paus telah mengkhianati gereja dengan mencoba menjembatani kesenjangan antara ilmu pengetahuan dan agama. Setelah McKenna membunuh Paus, ia berniat menjadikan dirinya terpilih untuk kepausan dan mengerahkan para Kardinal yang paling konservatif ke sisinya. Rekaman itu ditunjukkan kepada konklaf Paus, termasuk Kardinal Strauss (Armin Mueller-Stahl), dan baru diketahui oleh McKenna. McKenna kemudian melarikan diri ke Makam Santo Petrus di bawah gereja, tempat ia bisa bunuh diri dengan membakar dirinya sendiri.
Vatikan secara resmi mengumumkan bahwa McKenna meninggal karena luka dalam yang dideritanya selama pendaratan parasutnya dan Kardinal Baggia memilih nama Paus Lukas I, dengan Kardinal Strauss sebagai Camerlengo baru. Kardinal Strauss berterima kasih kepada Langdon atas bantuannya dan memberikan Langdon "Diagramma Veritatis" karya Galileo Galilei untuk penelitian Langdon sebagai hadiah dari dirinya dan Paus Lukas, meminta untuk dikembalikan ke Vatikan atas perjanjian Langdon dan referensi masa depan apapun yang mungkin dibuatnya tentang Gereja Katolik dilakukan dengan lembut, untuk itu Langdon menjawab, "Saya akan mencoba." Film ini berakhir dengan Paus Lukas mengangguk kepada Langdon dan Vittoria, lalu Paus berjalan ke balkon untuk menyambut orang-orang yang menunggunya di lapangan.
