Los sistemas de expresión más antiguos y más utilizados están basados en células y pueden definirse como la "combinación de un vector de expresión, su ADN clonado y el huésped para el vector que proporcionan un contexto para permitir la función del gen extraño en una célula huésped, es decir, producir proteínas a un alto nivel".[10][11] La sobreexpresión es un nivel anormal y excesivamente alto de expresión génica que produce un fenotipo pronunciado relacionado con el gen.[12][13]
Dado que las bacterias son procariotas, no están equipadas con toda la maquinaria enzimática para realizar las modificaciones postraduccionales o el plegamiento molecular necesarios. Por ello, las proteínas eucariotas multidominio expresadas en bacterias no suelen ser funcionales. Además, muchas proteínas se vuelven insolubles en forma de cuerpos de inclusión que son difíciles de recuperar sin desnaturalizantes agresivos y el consiguiente y engorroso repliegue de la proteína.
Para hacer frente a estos problemas, se han desarrollado sistemas de expresión que utilizan múltiples células eucariotas para aplicaciones que requieren que las proteínas estén conformadas como en los organismos eucariotas o más cerca de ellos: las células de plantas (por ejemplo, el tabaco), de insectos o de mamíferos (por ejemplo, los bovinos) se transfectan con genes y se cultivan en suspensión e incluso como tejidos u organismos enteros, para producir proteínas completamente plegadas. Sin embargo, los sistemas de expresión in vivo de mamíferos tienen un bajo rendimiento y otras limitaciones (tiempo, toxicidad para las células huésped, etc.). Para combinar las características de alto rendimiento/productividad y escalabilidad de las proteínas de las bacterias y las levaduras, y las características epigenéticas avanzadas de los sistemas de plantas, insectos y mamíferos, se desarrollan otros sistemas de producción de proteínas utilizando eucariotas unicelulares (es decir, células de "Leishmania" no patógenas).
Sistemas bacterianos
Escherichia coli
E. coli, uno de los huéspedes más populares para la expresión de genes artificiales.
E. coli es uno de los hospedadores de expresión más utilizados y el ADN normalmente se introduce en un vector de expresión plasmídico. Las técnicas para la sobreexpresión en E. coli están bien desarrolladas y funcionan aumentando el número de copias del gen o aumentando la fuerza de unión de la región promotora para ayudar a la transcripción.
Por ejemplo, una secuencia de ADN para una proteína de interés podría clonarse o subclonarse en un plásmido de alto número de copias que contiene el promotor lac (a menudo LacUV5 ), que luego se transforma en la bacteria E. coli . La adición de IPTG (un análogo de lactosa ) activa el promotor lac y hace que las bacterias expresen la proteína de interés.
Las cepas de E. coli BL21 y BL21 (DE3) son dos cepas comúnmente utilizadas para la producción de proteínas. Como miembros del linaje B, carecen de proteasas lon y OmpT, lo que protege las proteínas producidas de la degradación. El profago DE3 que se encuentra en BL21 (DE3) proporciona la ARN polimerasa de T7 (impulsada por el promotor LacUV5), lo que permite utilizar vectores con el promotor T7 en su lugar.[14]
Corynebacterium
Las especies no patógenas de Corynebacterium grampositiva se utilizan para la producción comercial de varios aminoácidos. La especie C. glutamicum se utiliza ampliamente para producir glutamato y lisina,[15] componentes de los alimentos humanos, los piensos y los productos farmacéuticos.
La expresión del factor de crecimiento epidérmico humano funcionalmente activo se ha llevado a cabo en C. glutamicum,[16] demostrando así un potencial para la producción a escala industrial de proteínas humanas. Las proteínas expresadas pueden dirigirse a la secreción a través de la vía secretora general (Sec) o la vía de translocación de arginina gemela (Tat).[17]
La bacteria no patógena y gramnegativa Pseudomonas fluorescens se utiliza para la producción de alto nivel de proteínas recombinantes, normalmente para el desarrollo de bioterapias y vacunas. P. fluorescens es un organismo metabólicamente versátil, que permite el cribado de alto rendimiento y el rápido desarrollo de proteínas complejas. P. fluorescens es más conocido por su capacidad de producir rápidamente y con éxito altos títulos de proteínas activas y solubles.[18]
Sistemas eucariotas
Levaduras
Los sistemas de expresión que utilizan S. cerevisiae o Pichia pastoris permiten la producción estable y duradera de proteínas que se procesan de manera similar a las células de mamíferos, con alto rendimiento, en medios de proteínas químicamente definidos.
Hongos filamentosos
Los hongos filamentosos, especialmente Aspergillus y Trichoderma, pero también más recientemente Myceliophthora thermophila C1[8] se han desarrollado en plataformas de expresión para la detección y producción de diversas enzimas industriales . El sistema de expresión C1 muestra una morfología de baja viscosidad en cultivo sumergido, lo que permite el uso de medios complejos de crecimiento y producción.
Células infectadas con baculovirus
Las células de insecto infectadas por baculovirus[19] (cepas Sf9, Sf21, High Five) o las células de mamífero[20] (HeLa, HEK 293) permiten la producción de proteínas glicosiladas o de membrana que no pueden producirse mediante sistemas fúngicos o bacterianos.[19] Es útil para la producción de proteínas en gran cantidad. Los genes no se expresan continuamente porque las células huésped infectadas acaban lisándose y muriendo durante cada ciclo de infección.[21]
Expresión de células de insectos no líticas
La expresión no lítica en células de insecto es una alternativa al sistema de expresión lítica por baculovirus. En la expresión no lítica, los vectores se transfectan de forma transitoria o estable en el ADN cromosómico de las células de insecto para la posterior expresión génica.[22][23] A continuación, se realiza la selección y el cribado de los clones recombinantes.[24] El sistema no lítico se ha utilizado para obtener un mayor rendimiento proteico y una expresión más rápida de los genes recombinantes en comparación con la expresión de células infectadas por baculovirus.[23] Las líneas celulares utilizadas para este sistema incluyen: Sf9, Sf21 de células de Spodoptera frugiperda, Hi-5 de células de Trichoplusia ni y células de Schneider 2 y células de Schneider 3 de células de Drosophila melanogaster.[22][24] Con este sistema, las células no se lisan y se pueden utilizar varios modos de cultivo.[22] Además, las series de producción de proteínas son reproducibles.[22][23] Este sistema da un producto homogéneo.[23] Un inconveniente de este sistema es el requisito de un paso de cribado adicional para seleccionar clones viables.[24]
Los sistemas de expresión de Leishmania tarentolae (no puede infectar a los mamíferos) permiten la producción estable y duradera de proteínas con alto rendimiento, en medios químicamente definidos. Las proteínas producidas exhiben modificaciones postraduccionales completamente eucariotas, incluida la glicosilación y la formación de enlaces disulfuro.
Sistemas de mamíferos
Los sistemas de expresión de mamíferos más comunes son las células de ovario de hámster chino (CHO) y de riñón embrionario humano (HEK).[25][26][27]
La producción de proteínas sin células se realiza in vitro utilizando ARN polimerasa, ribosomas, ARNt y ribonucleótidos purificados. Estos reactivos pueden producirse por extracción de células o a partir de un sistema de expresión celular. Debido a los bajos niveles de expresión y al elevado coste de los sistemas libres de células, los sistemas basados en células son más utilizados[28]
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